ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントに関する組成物および方法

专利摘要:
ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、たとえば配列番号１〜３５が提供される。本明細書において例示される特定のＴＥＥまたはその変異体、相同体もしくは機能的誘導体の１つまたは複数を含む翻訳エンハンサーポリヌクレオチドも提供される。さらに、こうしたＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこうしたベクターを有する宿主細胞および発現系が提供される。１つの局面において、翻訳エンハンサーとして機能し、かつ少なくとも１つのｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含む、単離または合成のポリヌクレオチド配列が提供される。
公开号:JP2011505831A
申请号:JP2010537974
申请日:2008-12-11
公开日:2011-03-03
发明作者:ジェラルド；エム． エデルマン，；ウェイ チョウ，；ヴィンセント；ピー． マウロ，
申请人:ザ スクリプス リサーチ インスティテュート；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] （関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／００７，４４０号の優先権利益を主張する。上記出願日の優先権が主張され、この米国仮特許出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。]
背景技術

[0002] 真核生物における翻訳は、４０Ｓリボソームサブユニットの加入（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）に続いて開始され、この加入は、ｍＲＮＡの５’末端に見出される修飾ヌクレオチドであるｍ７Ｇキャップ構造を介して起こるか、またはキャップ非依存的な機構によって起こり得る。後者は翻訳の内部開始と呼ばれ、さまざまな機構が介在し得る。いずれかの機構による加入の後、４０Ｓリボソームサブユニットは開始コドンに移動し、６０Ｓリボソームサブユニットが結合してペプチド合成が始まる。ｍＲＮＡの５’および３’末端の非コードセグメントに含まれる配列要素は、翻訳開始の効率に影響し得る。キャップ依存性ｍＲＮＡの翻訳を促進できる配列要素を、翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ：ＴＥＥｓ）と呼ぶ。]
[0003] いくつかのＴＥＥは、４０ＳリボソームサブユニットのＲＮＡ構成要素である１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ：ｒＲＮＡ）に対する塩基対形成を伴う機構によって、翻訳開始を促進する。いくつかのＴＥＥは、リボソーム加入部位（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｓｉｔｅ）として機能して翻訳の内部開始を促進することもできる；しかし、ほとんどの内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）はＴＥＥとして機能しない。]
課題を解決するための手段

[0004] 当該技術分野においては、バイオテクノロジーおよび遺伝子治療においてタンパク質発現を調節するために有用であり得るもっと多くのＴＥＥが要求されている。本開示はこの要求およびその他の要求に対処するものである。]
[0005] １つの局面において、翻訳エンハンサーとして機能し、かつ少なくとも１つのｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含む、単離または合成のポリヌクレオチド配列が提供される。ＴＥＥは、ＲＮＳＧＡＧＭＧＲＭＲ（配列番号１）もしくはＭＳＣＳＧＣＮＧＭＷＡ（配列番号２）、またはそれと実質的に同一の配列からなるポリヌクレオチド配列中に存在する。これらのポリヌクレオチド配列中に、各ＴＥＥの２つ以上のコピー（例えば、２、５、１０、２５、５０またはそれを超えるコピー）が存在していてもよい。]
[0006] ある実施形態において、ＴＥＥはＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）もしくはＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）、またはそれと実質的に同一の配列からなる。これらの配列において、Ｒ１は無いか、有るときにはＡまたはＧであり；Ｎ１は無いか、有るときにはＡ、ＣまたはＧであり、好ましくはＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくはＡまたはＧであり、Ｒ１およびＲ２は同じでも異なっていてもよく；Ｍ２は無いか、有るときにはＡまたはＣであり、好ましくはＡまたはＣであり；Ｒ３は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくは無く；Ｒ４は無いか、有るときにはＣであり、好ましくは無く；Ｒ５は無いか、有るときにはＡであり、好ましくは無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＣまたはＡであり、好ましくはＣまたはＡであり；Ｓ２は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｓ３はＧまたはＣであり；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ４はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡまたはＴであり、Ｒ６は無いか、有るときにはＡである。]
[0007] 別の実施形態において、ＴＥＥはＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４からなる。この配列において、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は無く；Ｎ１はＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１はＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２はＡまたはＧであり、Ｍ２はＡまたはＣである。別の実施形態において、ＴＥＥはＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６からなる。この配列において、Ｒ５およびＲ６は無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＡまたはＣであり；Ｓ２はＣまたはＧであり；Ｓ３はＣまたはＧであり、Ｓ２およびＳ３は同じでも異なっていてもよく；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ２はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡである。]
[0008] いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号５〜３５からの配列と少なくとも９０％同一の配列を有するＴＥＥを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号：５〜３５の配列の１つと同一の配列を有するＴＥＥを含む。]
[0009] ポリヌクレオチド配列のいくつかには、少なくとも２コピーのＴＥＥが存在する。ポリヌクレオチド配列のいくつかには、３コピー以上のＴＥＥが存在する。いくつかの他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は少なくとも５コピーのＴＥＥ、少なくとも１０コピー、少なくとも２５コピーまたはそれを超えるコピーのＴＥＥを含む。]
[0010] 関連する局面においては、真核生物細胞において組換えによってポリペプチドを発現するためのクローニングベクターまたは発現ベクターが提供される。ベクターは、本明細書に開示される少なくとも１つのｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含むポリヌクレオチド配列に動作可能に連結した真核生物プロモーターを含有する。ベクター中に存在するＴＥＥは、ＲＮＳＧＡＧＭＧＲＭＲ（配列番号１）もしくはＭＳＣＳＧＣＮＧＭＷＡ（配列番号２）、またはそれと実質的に同一の配列からなる。]
[0011] ある実施形態において、ベクター中に存在するＴＥＥは、Ｒ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）もしくはＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）、またはそれと実質的に同一の配列からなる。これらの配列において、Ｒ１は無いか、有るときにはＡまたはＧであり；Ｎ１は無いか、有るときにはＡ、ＣまたはＧであり、好ましくはＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくはＡまたはＧであり、Ｒ１およびＲ２は同じでも異なっていてもよく；Ｍ２は無いか、有るときにはＡまたはＣであり、好ましくはＡまたはＣであり；Ｒ３は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくは無く；Ｒ４は無いか、有るときにはＣであり、好ましくは無く；Ｒ５は無いか、有るときにはＡであり、好ましくは無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＣまたはＡであり、好ましくはＣまたはＡであり；Ｓ２は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｓ３はＧまたはＣであり；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ４はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡまたはＴであり、Ｒ６は無いか、有るときにはＡである。]
[0012] 別の実施形態において、ベクター中に存在するＴＥＥは、Ｒ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４からなる。この配列において、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は無く；Ｎ１はＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１はＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２はＡまたはＧであり、Ｍ２はＡまたはＣである。別の実施形態において、ベクター中に存在するＴＥＥは、Ｒ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６からなる。この配列において、Ｒ５およびＲ６は無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＡまたはＣであり；Ｓ２はＣまたはＧであり；Ｓ３はＣまたはＧであり、Ｓ２およびＳ３は同じでも異なっていてもよく；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ２はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡである。]
[0013] ベクターのいくつかにおいて、ＴＥＥは、配列番号５〜３５から選択される配列と実質的に同一の配列からなる。いくつかのその他のベクターにおいて、ＴＥＥは、配列番号５〜３５から選択される配列と同一の配列からなる。]
[0014] いくつかのベクターにおいて、ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、プロモーターに対して３’に位置し、目的のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の方向性ライゲーション（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）に対して適合される。これらのベクターのいくつかは、ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントに動作可能に連結した目的のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかのベクターにおいて、ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、第２のポリヌクレオチド配列の５’リーダーに位置する。本明細書に開示されるとおりの、目的の抗原を発現するベクターを含むＤＮＡワクチンがさらに提供される。このベクターによってトランスフェクトされる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの真核生物宿主細胞）がさらに提供される。]
[0015] さらなる局面において、目的のポリペプチドを組換えによって生成するための方法が提供される。この方法は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに各々動作可能に連結した真核生物プロモーターと、少なくとも１コピー（例えば、１、２、３、４、５、１０、２５、５０コピーまたはそれを超えるコピー）のｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントとを含む発現ベクターを構築する工程を伴う。その後、この発現ベクターを真核生物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトし、次いで発現ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞を培養する。ある実施形態において、ベクター中に存在するｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）は、ＲＮＳＧＡＧＭＧＲＭＲ（配列番号１）もしくはＭＳＣＳＧＣＮＧＭＷＡ（配列番号２）、またはそれと実質的に同一の配列からなる。]
[0016] ある実施形態において、ベクター中に存在するＴＥＥは、Ｒ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）もしくはＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）、またはそれと実質的に同一の配列からなる。これらの配列において、Ｒ１は無いか、有るときにはＡまたはＧであり；Ｎ１は無いか、有るときにはＡ、ＣまたはＧであり、好ましくはＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくはＡまたはＧであり、Ｒ１およびＲ２は同じでも異なっていてもよく；Ｍ２は無いか、有るときにはＡまたはＣであり、好ましくはＡまたはＣであり；Ｒ３は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくは無く；Ｒ４は無いか、有るときにはＣであり、好ましくは無く；Ｒ５は無いか、有るときにはＡであり、好ましくは無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＣまたはＡであり、好ましくはＣまたはＡであり；Ｓ２は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｓ３はＧまたはＣであり；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ４はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡまたはＴであり、Ｒ６は無いか、有るときにはＡである。]
[0017] 別の実施形態において、ベクター中に存在するＴＥＥは、Ｒ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４からなる。この配列において、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は無く；Ｎ１はＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１はＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２はＡまたはＧであり、Ｍ２はＡまたはＣである。別の実施形態において、ベクター中に存在するＴＥＥは、Ｒ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６からなる。この配列において、Ｒ５およびＲ６は無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＡまたはＣであり；Ｓ２はＣまたはＧであり；Ｓ３はＣまたはＧであり、Ｓ２およびＳ３は同じでも異なっていてもよく；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ２はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡである。]
[0018] ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と実質的に同一の配列からなっていてもよい。いくつかの方法において、ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と同一の配列からなる。いくつかの方法は、発現された組換えポリペプチドを、宿主細胞からまたは培養された宿主細胞を囲む培地から精製する工程をさらに伴うことがある。本明細書に記載される方法によって、目的とするさまざまなポリペプチドを生成できる。たとえば、臨床的重要性の高いいくつかの治療タンパク質は、本方法に対して好適である。]
[0019] 本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現するであろう。]
図面の簡単な説明

[0020] 翻訳エンハンサーに駆動されるポジティブフィードバックベクターを、さまざまなプロモーター（Ｐ１）および転写エンハンサー（Ｐ２）配列、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：ＴＦ）遺伝子、および目的のタンパク質とともに模式的に表わす。
図１と同様の翻訳エンハンサーに駆動されるポジティブフィードバックベクターを、宿主タンパク質合成を遮断するための第３のタンパク質とともに模式的に表わす。
ＣＨＯ細胞中の５から２５コピー（５Ｘ〜２５Ｘ）のさまざまなＴＥＥエレメントによる翻訳促進の翻訳促進活性を、サイズを合わせた対照コンストラクトの活性と比較して示す。
さまざまなＴＥＥエレメントから推定されるコンセンサスモチーフを示す。
モチーフ配列１（配列番号１）またはモチーフ配列２（配列番号２）に基づく合成配列の翻訳促進活性を、サイズを合わせた対照コンストラクトの活性と比較して示す。] 図１
[0021] Ｉ．概要
本明細書において開示されるのは、新規のｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）である。特に、以下の実施例に詳述されるとおり、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯおよびＢＨＫ細胞系）における翻訳を促進できるいくつかの短いヌクレオチド配列が同定される。これらの短いヌクレオチド配列からのコンセンサスモチーフまたはＴＥＥが開示される。ある実施形態において、モチーフ１はＲＮＳＧＡＧＭＧＲＭＲ（配列番号１）であり、モチーフ２はＭＳＣＳＧＣＮＧＭＷＡ（配列番号２）である。なおこれらの配列において、ＲはＡまたはＧを示し、ＭはＡまたはＣを示し、ＳはＧまたはＣを示し、ＷはＡまたはＵ（Ｔ）を示し、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵ（Ｔ）を示す。]
[0022] 別の実施形態において、モチーフ１はＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）である。この配列において、Ｒ１は無いか、有るときにはＡまたはＧであり；Ｎ１は無いか、有るときにはＡ、ＣまたはＧであり、好ましくはＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくはＡまたはＧであり、Ｒ１およびＲ２は同じでも異なっていてもよく；Ｍ２は無いか、有るときにはＡまたはＣであり、好ましくはＡまたはＣであり；Ｒ３は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくは無く；Ｒ４は無いか、有るときにはＣであり、好ましくは無い。別の実施形態において、モチーフ１はＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）であり、ここでＲ１、Ｒ３およびＲ４は無く；Ｎ１はＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１はＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２はＡまたはＧであり、Ｍ２はＡまたはＣである。]
[0023] 別の実施形態において、モチーフ２はＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）である。この配列において、Ｒ５は無いか、有るときにはＡであり、好ましくは無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＣまたはＡであり、好ましくはＣまたはＡであり；Ｓ２は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｓ３はＧまたはＣであり；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ４はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡまたはＴであり、Ｒ６は無いか、有るときにはＡである。別の実施形態において、モチーフ２はＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）であり、ここでＲ５およびＲ６は無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＡまたはＣであり；Ｓ２はＣまたはＧであり；Ｓ３はＣまたはＧであり、Ｓ２およびＳ３は同じでも異なっていてもよく；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ２はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡである。]
[0024] 加えて、コンセンサスモチーフに基づいて合成された、いくつかの特定の配列が開示される（例えば、配列番号５〜３５）。これらの合成配列は、モチーフ配列を同定するために用いた配列中には示されていない。合成配列は翻訳活性の促進を示す。１コピーまたは複数コピーのこれらの配列を含有するポリヌクレオチド配列は、翻訳を最高２５倍促進できる。]
[0025] 本明細書において開示される少なくとも１つのｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）の１コピーまたはそれを超えるコピーを含有する、単離されたかまたは実質的に精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）である翻訳エンハンサーが本明細書において開示される。これらのポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結したときに、翻訳エンハンサーとして機能できる。例示的なＴＥＥを配列番号１〜３５に示す。なお、本明細書においてはＴＥＥをデオキシリボヌクレオチド配列で示しているが、対応するリボヌクレオチド配列もＴＥＥまたはＴＥＥを含むポリヌクレオチドに含まれることが容易に認識されるべきである。本明細書において開示されるＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを含有するクローニングベクターまたは発現ベクター、およびこうしたベクターを有する宿主細胞も提供される。さらに、ＴＥＥ、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドおよび発現ベクターを用いて所望のポリペプチド（例えば、治療タンパク質）の翻訳および生成を促進する方法が提供される。]
[0026] 別様に示されない限り、開示される方法は、当該技術分野の技術の範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。こうした技術は文献において十分に説明されている。たとえば、以下の文献に例示的な方法が記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（第３版，２００１）；Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（第４版，２０００）。]
[0027] ＩＩ．定義
この明細書は、記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されない。これらは変動し得るためである。さらに、本明細書において用いられる用語は特定の実施形態を説明する目的のみに対するものであって、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限することは意図されていないことが理解されるべきである。]
[0028] 本明細書において用いられる単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明らかに別様を示さない限り、複数の言及を含む。よって、たとえば「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は複数のこうした細胞を含み、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は１つまたはそれを超えるタンパク質および当業者に公知のその同等物を含み、他も同様である。]
[0029] 別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。以下の文献は、本開示において用いられる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供するものである：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（編．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（第１版，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（改訂版，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（編），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（第３版，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（編），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（第１版，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｎａｎｄａｎｄ（編），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｉｎｅ（編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（第４版，２０００）。これらの用語のうち、この開示に対して具体的に適用されるいくつかの用語のさらなる説明を本明細書において提供する。]
[0030] 「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、あらゆる物質、分子、構成要素、化合物、実体、またはその組合せを含む。薬剤は、たとえばタンパク質、ポリペプチド、小さい有機分子、多糖、ポリヌクレオチドなどを含むがそれらに限定されない。薬剤は、天然産物、合成化合物、もしくは化合物、または２つもしくはそれを超える物質の組合せであってもよい。別様に特定されない限り、「薬剤」、「物質」および「化合物」という用語は、本明細書において互いに交換可能に用いられる。]
[0031] 「シストロン」という用語は、単一のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡの単位を意味する。「転写単位」という用語は、ＲＮＡの合成が起こるＤＮＡのセグメントを指す。]
[0032] 「ＤＮＡワクチン」という用語は、宿主細胞または組織の中に導入でき、そこで細胞によって発現されることによってメッセンジャーリボ核酸（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ｍＲＮＡ）分子を生成し、次いでそれが翻訳されることによってＤＮＡにコードされるワクチン抗原が生成されるようなＤＮＡを示す。]
[0033] 「目的の遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」という言葉は、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）によって生成を調節されるタンパク質生成物（目的のタンパク質）をコードするシストロン、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）、またはポリヌクレオチド配列を含むことが意図される。目的の遺伝子の例には、治療タンパク質、栄養タンパク質および産業的に有用なタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。目的の遺伝子は、レポーター遺伝子または選択可能なマーカー遺伝子、たとえば高感度緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＲｅｎｉｌｌａまたはＰｈｏｔｉｎｕｓ）なども含み得る。]
[0034] 発現とは、ＤＮＡからポリペプチドを生成するプロセスのことである。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写と、その後のｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を伴う。]
[0035] 本明細書において用いられる「内因性」という用語は、通常野生型の宿主に見出される遺伝子を示すのに対し、「外因性」という用語は、通常野生型の宿主に見出されない遺伝子を示す。]
[0036] 「宿主細胞」とは、異種ポリヌクレオチド配列が導入されるかまたは導入された生細胞を示す。生細胞は、培養細胞および生きた生物内の細胞の両方を含む。細胞に異種ポリヌクレオチド配列を導入するための手段は周知であり、たとえばトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、および／またはその類似手段などである。しばしば、細胞に導入される異種ポリヌクレオチド配列は複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターである。いくつかの実施形態においては、宿主細胞を操作してその染色体上またはそのゲノム中に所望の遺伝子を組込んでもよい。当該技術分野において周知であるとおり、多くの宿主細胞が使用可能であり（例えば、ＣＨＯ細胞）、宿主として働き得る。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（第３版，２００１）；およびＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）を参照。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞である。]
[0037] 「相同体」という用語は、参照配列（例えば、本明細書に開示される特定のｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント）の構造と実質的に同一である構造（例えば、ヌクレオチド配列）を有する配列を示す。相同体は典型的に、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの翻訳を促進する能力を維持する。レポーター遺伝子または目的の遺伝子に動作可能に連結したプロモーターを含有する発現ベクターにおける適切な位置に変異配列を挿入して、上述の参照配列中に変異を作成することによって、相同体の活性をスクリーニングしてもよい。次いで宿主細胞に発現ベクターを導入して、遺伝子にコードされるタンパク質の翻訳を調べてもよい。レポーター遺伝子からの翻訳が、参照エンハンサー配列の制御下のレポーター遺伝子の翻訳と同じであれば、その変異配列は機能的相同体である。]
[0038] 「誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」という用語は、誘導可能な翻訳調節エレメントからの翻訳をもたらす化学的、生物的または物理的な薬剤を示すために用いられる。誘導剤への露出に応答して、このエレメントからの翻訳が一般的には新規に(ｄｅ ｎｏｖｏ)開始されるか、または発現の基底レベルもしくは恒常的レベルよりも増加する。誘導剤は、たとえば細胞が露出されるストレス条件、たとえば熱ショックまたは寒冷ショック、重金属イオンなどの毒性薬剤、または栄養、ホルモン、成長因子の欠乏などであってもよく；または、細胞の生育状態もしくは分化状態に影響する化合物、たとえばホルモンもしくは成長因子などであってもよい。]
[0039] 「単離または精製ポリヌクレオチド」という語句は、生物の天然に存在するゲノム中ですぐに隣接する配列からその両端が単離された一片のポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）を含むことが意図される。精製ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖のいずれかであるオリゴヌクレオチド；ベクターに組込まれたポリヌクレオチド断片；真核生物または原核生物のゲノムに挿入された断片；またはプローブとして用いられる断片であってもよい。ポリヌクレオチドに言及しているときの「実質的に純粋」という語句は、その分子がその他の付随する生物学的構成要素から分離されて、典型的にはサンプルの少なくとも８５パーセントまたはそれを超えるパーセンテージを有することを意味する。]
[0040] 「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを示し、別様に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の態様で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。核酸配列は、たとえば原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ配列、真核生物ＤＮＡ（例えば、哺乳動物のＤＮＡ）からのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列または合成ＲＮＡ配列であり得るがこれらに限定されない。]
[0041] 「プロモーター」という用語は、転写を指示することができ、そこから転写が開始される核酸配列を意味する。当該技術分野において、さまざまなプロモーター配列が公知である。たとえばこうしたエレメントは、ＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、およびＴ３プロモーター）、ＳＰ１部位、およびサイクリックＡＭＰ応答エレメントを含み得るが、これらに限定されない。プロモーターが誘導可能なタイプであるとき、その活性は誘導剤に応答して増加する。]
[0042] ５’リーダーまたは非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）（５’リーダー、５’リーダー配列または５’ＵＴＲ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびそれをコードするＤＮＡの特別な部分である。５’リーダーは＋１位置（転写が始まるところ）から始まり、コード領域の開始コドン（通常はＡＵＧ）の直前に終わる。バクテリアでは、５’リーダーはＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列として公知のリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ：ＲＢＳ）を含有することがある。５’リーダーは１００ヌクレオチドまたはそれを超える長さであってもよく、３’ＵＴＲはそれより長くてもよい（最高数キロベースの長さ）。]
[0043] 「動作可能に連結している（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「動作可能に結合している（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、遺伝子エレメントの通常の機能を行なえるような態様で連結された遺伝子エレメント間の機能的結合を示す。たとえば、ある遺伝子の転写がプロモーターの制御下にあり、生成された転写物は通常その遺伝子がコードするタンパク質に正しく翻訳されるとき、その遺伝子はプロモーターに動作可能に連結している。同様に、翻訳エンハンサーエレメントが目的の遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳のアップレギュレーションを可能にするとき、その翻訳エンハンサーエレメントは目的の遺伝子に動作可能に関連付けられている。]
[0044] 方向性ライゲーション（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）に対して適合されたヌクレオチドの配列、たとえばポリリンカーは、ポリヌクレオチド配列のベクターへの方向性ライゲーションのための部位または手段を提供する、発現ベクターの領域である。典型的に、方向性ポリリンカーは、２つまたはそれを超える制限エンドヌクレアーゼ認識配列または制限酵素認識部位を定めるヌクレオチドの配列である。制限酵素切断の際に、２つの部位は付着端をもたらし、発現ベクターに対してその付着端にポリヌクレオチド配列を結合できる。ある実施形態において、制限酵素切断の際に２つの制限酵素認識部位は非相補的な付着端を与えることによって、カセットへのポリヌクレオチド配列の方向性挿入を可能にする。たとえば、方向性ライゲーションに対して適合されたヌクレオチドの配列は、複数の方向性クローニング手段を定めるヌクレオチドの配列を含有し得る。方向性ライゲーションに対して適合されたヌクレオチドの配列が多数の制限酵素認識部位を定めるとき、その配列はマルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）と呼ばれる。]
[0045] 処置の目的に対する「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、哺乳動物として分類されるあらゆる動物、たとえばヒトおよびヒト以外の哺乳動物を示す。ヒト以外の動物の例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。注記されるときを除き、「患者」または「対象」という用語は本明細書において互いに交換可能に用いられる。ある実施形態において、対象はヒトである。]
[0046] 転写因子とは、転写を開始または調節するために必要なあらゆるポリペプチドを示す。たとえば、こうした因子はｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ｃＥｔｓ、ＧＡＴＡ、ＧＡＬ４、ＧＡＬ４／Ｖｐ１６、ｃ−Ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、ＮＦ−κＢ、バクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｆ−１、およびＴＲＥを含むがこれらに限定されない。こうした因子をコードする配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０２２７６（ｃ−Ｍｙｃ）、Ｋ００６５０（ｃ−ｆｏｓ）、ＢＣ００２９８１（ｃ−ｊｕｎ）、Ｍ２７６９１（ＣＲＥＢ）、Ｘ１４７９８（ｃＥｔｓ）、Ｍ７７８１０（ＧＡＴＡ）、Ｋ０１４８６（ＧＡＬ４）、ＡＹ１３６６３２（ＧＡＬ４／Ｖｐ１６）、Ｍ９５５８４（ｃ−Ｍｙｂ）、Ｍ８４９１８（ＭｙｏＤ）、２００６２９３Ａ（ＮＦ−κＢ）、ＮＰ８５３５６８（ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、ＡＡＢ２８１１１（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、ＮＰ５２３３０１（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ）、ＡＦ３６４６０４（ＨＩＦ−１）、およびＸ６３５４７（ＴＲＥ）を含むがこれらに限定されない。]
[0047] 「実質的に同一の」核酸配列またはアミノ酸配列とは、標準的なパラメータを用いて、本明細書に記載される周知のプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって測定したときに、参照配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸配列またはアミノ酸配列を示す。配列同一性は少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であってもよい。いくつかの実施形態において、対象配列は参照配列に比べてほぼ同じ長さであり、すなわちほぼ同数の隣接する（ポリペプチド配列に対する）アミノ酸残基または（ポリヌクレオチド配列に対する）ヌクレオチド残基からなっている。]
[0048] 配列同一性は、当該技術分野において公知のさまざまな方法によって容易に決定できる。たとえば、（ヌクレオチド配列に対する）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとしてワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ：Ｗ）１１、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ：Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにおいて２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に対して、（付加または欠失を含まない）参照配列に比べて付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸塩基がある位置の数を定めてマッチした位置の数を得て、そのマッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の合計数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。]
[0049] 「翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）」という用語は、ｍＲＮＡから生成されるポリペプチドまたはタンパク質の量を、キャップ構造単独からの翻訳レベルよりも増加させるシス作用性の配列を示す。当該技術分野において公知のＴＥＥの例は、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダー中の配列を含む（Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：９５９０−９５９４，２００４）。加えて、たとえば配列番号１〜３５の新規のＴＥＥが本明細書において開示される。別様に示されない限り、ＴＥＥは、ｍＲＮＡ配列における翻訳促進エレメントと、ＤＮＡ配列における対応するコード配列エレメントとの両方を示す。]
[0050] 「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」とは、本明細書において例示される特定のＴＥＥ（すなわち配列番号１〜３５）またはその変異体、相同体もしくは機能的誘導体の１つまたはそれを超えて含むポリヌクレオチドのことである。このポリヌクレオチド中には１コピーまたは複数コピーの特定のＴＥＥが存在できる。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つまたはそれを超える配列セグメントに組織化されていてもよい。配列セグメントは本明細書において例示される特定の１つまたはそれを超えるＴＥＥ有することができ、各ＴＥＥは１コピーまたはそれを超えて存在する。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に複数の配列セグメントが存在するとき、それらは同種であっても異種であってもよい。よって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、本明細書において例示される特定のＴＥＥの同一タイプもしくは異なるタイプ、同一もしくは異なるコピー数の各特定のＴＥＥ、および／またはＴＥＥの同一もしくは異なる組織を各配列セグメント内に有し得る。]
[0051] 「処置する」または「緩和する」という用語は、化合物または薬剤を対象に投与することによって、症状、合併症または疾患の生化学的兆候（例えば、心機能不全）の発症を予防または遅延させるか、症状を緩和するか、疾患、状態または障害のさらなる発達を抑制または阻害することを含む。処置を必要とする対象は、すでに疾患または障害を患う患者に加えて、その障害を起こしやすい患者またはその障害を防ぐべき患者を含む。]
[0052] 処置は（疾患の発症を予防もしくは遅延させるため、または疾患の臨床的症状もしくは無症候性の症状の出現を予防するために）予防的であってもよいし、疾患の出現後の症状の治療的抑制または緩和であってもよい。心臓の再構築および／または心不全の処置において、治療剤は疾患の病状を直接減少させてもよいし、その疾患が他の治療剤による処置の影響をより受けやすくなるようにしてもよい。]
[0053] 「ベクター」または「コンストラクト」という用語は、これらのエレメントに動作可能に連結した遺伝子／遺伝子産物の発現が予想通りに制御され得るように、明確なパターンの組織に配置されたポリヌクレオチド配列エレメントを示す。それらは典型的に伝播性のポリヌクレオチド配列（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり、その中に外来ＤＮＡのセグメントをスプライスすることによって、その外来ＤＮＡを宿主細胞に導入してその複製および／または転写を促進することができる。]
[0054] クローニングベクターとは、宿主細胞中で自律的に複製できるＤＮＡ配列（典型的にはプラスミドまたはファージ）であり、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる。これらの部位において外来ＤＮＡ断片がベクターにスプライスされることによって、この断片の複製およびクローニングがもたらされてもよい。ベクターは、形質転換された細胞の識別に用いるために好適な１つまたはそれを超えるマーカーを含んでもよい。たとえば、マーカーはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与えてもよい。]
[0055] 発現ベクターはクローニングベクターと似ているが、宿主への形質転換後に、発現ベクターにクローニングされたＤＮＡの発現を誘導できる。クローニングされたＤＮＡは通常、プロモーターまたはエンハンサーなどの特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、動作可能に連結する）。プロモーター配列は構成的、誘導可能または抑圧可能であってもよい。]
[0056] ＩＩＩ．翻訳エンハンサーポリヌクレオチドおよび組換えベクター
本明細書において提供されるのは、翻訳エンハンサーとして機能する単離されたまたは実質的に精製されたポリヌクレオチドである。これらの翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特定のｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）またはその変異体、相同体もしくは機能的誘導体を含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは、コンセンサスモチーフ１（配列番号１）、モチーフ２（配列番号２）、モチーフ１ａ（配列番号３）、またはモチーフ２ａ（配列番号４）を含む１つまたはそれを超える配列セグメントを含有し得る。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号５〜３５に示される特定のｍＲＮＡ ＴＥＥの１つを含む１つまたはそれを超える配列セグメントを含有し得る。以下の実施例に実証されるとおり、これらのｍＲＮＡ ＴＥＥの１つを有するベクターにおいて目的のポリペプチドを発現することによって、タンパク質生成が顕著に増加する。配列番号１〜３５に示されるｍＲＮＡ ＴＥＥに加えて、ｍＲＮＡ ＴＥＥは、これらの例示される配列の１つと実質的に同一であり、かつ宿主細胞において動作可能に連結した目的遺伝子の発現を促進するという基本的な機能的特徴を保持できるような配列も包含し得る。]
[0057] 翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の配列セグメントは、配列番号１〜３５に示されるただ１つの特定のｍＲＮＡＴＥＥまたはいくつかのｍＲＮＡ ＴＥＥを含有してもよい。配列セグメント中に存在する特定のｍＲＮＡ ＴＥＥの各々に対して、配列セグメント中に１コピーのｍＲＮＡ ＴＥＥのみが存在してもよい。代替的には、各配列セグメント中に複数コピーの各ｍＲＮＡ ＴＥＥが存在してもよい。典型的には、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の異なるｍＲＮＡ ＴＥＥエレメントは、互いに隣接して操作的に連結していてもよいし、１ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さまで変動し得るスペーサーヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。いくつかの翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは、ただ１つの配列セグメントを含有する。いくつかの他の翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは、複数の配列セグメントを含有する。後者の実施形態において、配列セグメントは同種であっても異種であってもよい。]
[0058] よっていくつかの実施形態は、配列番号１〜３５に示される配列の１つと同じであるか、または実質的に同一であるｍＲＮＡＴＥＥ配列を含む翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列セグメントに関する。いくつかの他の実施形態は、配列番号１〜３５に示される特定のｍＲＮＡ ＴＥＥの２、３、４、５、１０、２５、５０コピーまたはそれを超えて含有する翻訳エンハンサーポリペプチド配列セグメントに関する。いくつかの実施形態において、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは、配列番号１〜３５に示される異なるｍＲＮＡ ＴＥＥまたはその変異体もしくは相同体の２つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれを超えて）を含有する配列セグメントに関する。これらの実施形態において、特定のｍＲＮＡ ＴＥＥの各々は１コピーまたはそれを超えて（例えば、２、３、４、５、１０、２５コピーまたはそれを超えて）存在してもよい。さらにいくつかの他の実施形態において、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは上に示す配列セグメントの２つ以上を含有する。異なる配列セグメントは、特定のｍＲＮＡ ＴＥＥのタイプと、中に含まれる各特定のｍＲＮＡ ＴＥＥのコピー数とに関しては同一であってもよい。代替的には、複数の配列セグメントは、特定のｍＲＮＡ ＴＥＥのタイプおよび／または各特定のｍＲＮＡ ＴＥＥのコピー数が異なっていてもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、配列番号１〜３５に示されるｍＲＮＡ ＴＥＥ以外のもの、これらの特定のＴＥＥの変異体または実質的に配列同一性を有する相同体も用いられ得る。]
[0059] 本明細書に開示される特定のｍＲＮＡＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを用いて、組換えクローニングベクターまたは発現ベクターを構築できる。こうしたベクターは、目的のポリペプチドまたはタンパク質（たとえば治療タンパク質）を発現させるために有用である。こうしたベクターは、ＤＮＡワクチンまたは遺伝子治療などの治療的適用にも用いられ得る。組換えベクターは、プラスミド、ウイルスまたは当該技術分野において公知のその他のビークルから、本明細書に記載される特定のｍＲＮＡ ＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドの１つまたはそれを超える挿入または組込みによって構築できる。こうしたビークルの例は、以下の実施例に考察されている。典型的に、ベクターは、宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）における目的のポリペプチドの発現に好適なプロモーターを含有する。ベクターにおいて、ＴＥＥ含有配列はプロモーターに動作可能に連結し、たとえば３’においてプロモーターに連結する。ＴＥＥ含有配列は、配列番号１〜３５に示される特定のＴＥＥの１つ、上述のとおりのＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを含む配列セグメントであってもよい。ベクターは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の方向性ライゲーションに対して適合されたヌクレオチドの配列を付加的に有し得る。たとえば、ポリヌクレオチド配列をクローニングするためにポリリンカーを用いることによって、クローニングされた配列がプロモーターおよびＴＥＥ含有配列に動作可能に連結してその制御下に置かれるようにできる。ポリリンカーは、一連の３つまたはそれを超える密接に並んだ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を有し得るポリヌクレオチド配列である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記を参照）。いくつかの実施形態においては、実施例に示されるとおり、ベクターは、目的のポリペプチドをコードする転写されたｍＲＮＡの５’リーダーにＴＥＥが存在するような位置において、ポリヌクレオチド配列がベクターにクローニングされることを可能にする。]
[0060] プロモーターおよびＴＥＥ含有配列に加えて、本明細書に記載されるいくつかの組換えベクターは、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする目的の遺伝子または目的のポリヌクレオチドをさらに含有する。目的の遺伝子または目的のポリヌクレオチド配列は、宿主細胞において挿入されたポリヌクレオチド配列の効率的な転写を促進するＴＥＥおよびプロモーター配列に動作可能に連結する。真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、ｍＲＮＡのメチオニンをコードするＡＵＧコドンにおいて始まる。このため、プロモーターと目的の遺伝子との間の結合は、メチオニンに対するいかなる介在コドンも含んではならない。こうしたコドンが存在すると、（そのＡＵＧコドンが目的の遺伝子と同じリーディングフレームにあれば）融合タンパク質が形成されるか、または本物の開始コドンの上流で終結するか、もしくは異なるリーディングフレームで目的の遺伝子に重複するペプチドが形成されるおそれがある。いくつかの実施形態において、タンパク質をコードする目的遺伝子は、５’リーダーと３’非翻訳（ＵＴＲ）配列とを含む。いくつかの他の実施形態において、産出される転写産物中の５’リーダーおよび／または３’非翻訳領域は、目的の遺伝子のクローニングの前にすでにベクター中に存在する。これらの実施形態においては、少なくとも１つのＴＥＥが５’リーダーおよび／または３’非翻訳領域に位置する。]
[0061] 典型的に、翻訳エンハンサーは転写プロモーターとＡＵＧコドンとの間に位置する。プロモーターおよび目的遺伝子のキャップ部位に対応するＴＥＥの正確な位置は重要ではない；しかし、正確な位置は効率に影響し得る。たとえば、いくつかのＴＥＥは、コードされるｍＲＮＡの５’リーダーまたは３’非翻訳領域中に位置するときに翻訳を促進できる。いくつかの実施形態において、ＴＥＥは目的遺伝子またはシストロンの５’リーダー配列中に位置する。これらの実施形態において、エンハンサーエレメントは、翻訳開始部位から約１〜５００ヌクレオチド以内、特定的には約１〜１００ヌクレオチドまたは約１〜５０ヌクレオチド以内に位置決めされる。]
[0062] 上述の翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを組込むことによって、組換えベクターは、配列番号１〜３５に示される特定の翻訳エンハンサーエレメントの１つまたはそれを超えて有し得る。これらの特定のエンハンサーエレメントのいずれに対しても、ベクターは１コピーのみのエンハンサーエレメントを有するか、または複数コピーの同じエンハンサーエレメントを有し得る。たとえば、関連するシストロンからのポリペプチド発現を増加させるために、いくつかの組換え発現ベクターには、配列番号１〜３５に示される特定のＴＥＥの２、５、１０、２０、３５、５０または７５コピーのコンカテマーが存在してもよい。いくつかの他のベクターは、本明細書において例示される特定のＴＥＥ配列の１つまたはそれ以上を独立に含み得る複数の配列セグメントを有する。]
[0063] 加えて、組換えベクターまたは発現ベクターは付加的な配列エレメントを含有できる。たとえば、ベクターは複製開始点、およびトランスフェクトされたかまたは形質転換された宿主細胞の表現型の選択を可能にする特異的マーカーを含有できる。ベクター中に存在するその他のエレメントは宿主細胞型によって異なるが、一般的には、転写および翻訳の開始に関与する配列、ならびに転写の終結をシグナル伝達する配列を含む。転写エンハンサー配列も存在してもよい。ベクターは、同じ転写単位内のコード配列、リボソーム結合部位およびポリアデニル化部位などの調節エレメント、同じプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下にある付加的な転写単位、クローニング、発現および宿主細胞の形質転換を可能にする配列も含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、クローニングされた目的遺伝子にコードされるポリペプチドを宿主細胞の表面に方向付けるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、レポーター遺伝子を発現する宿主細胞の、レポーター遺伝子を発現しない宿主細胞からの分離を促進できる分子タグをコードするポリヌクレオチドも含み得る。]
[0064] いくつかの実施形態において、組換えベクターは、真核生物宿主細胞における目的タンパク質の発現に対して意図されている。以下に詳述するとおり、これらの宿主細胞はさまざまな哺乳動物細胞および昆虫細胞または植物細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される発現ベクターから標的抗原を発現するＤＮＡワクチンが提供される。真核生物において使用するために好適な多数のベクターが当該技術分野において公知である。その例には以下が含まれる：哺乳動物細胞における発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５２１，１９８８）；昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来のベクター；ならびに以下に記載されるとおりの真核生物における発現のためのその他のベクター：Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉａｍｉ Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｙｍｐ．１９：２６５，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ Ｃｅｌｌ ２８：２０３，１９８２；Ｂｏｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９，１９８０；およびＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＰｒｅｓｃｏｔｔ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（１９８０）。いくつかの実施形態においては、相同組換えに対して設計されたＤＮＡコンストラクトに翻訳エンハンサーエレメントまたはポリヌクレオチドが組込まれる。こうしたコンストラクトは、たとえばＣａｐｅｃｃｈｉ，ＴＩＧ ５：７０，１９８９；Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８，１９８８；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１：５０３，１９８７；およびＤｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６，１９８７に記載される。]
[0065] 目的のタンパク質を発現するベクターに対して、ｍＲＮＡＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドは典型的に、上述のとおりプロモーターなどの調節エレメントに動作可能に連結してベクター中に存在する。特定の目的タンパク質および使用されるベクター／宿主系に依存して、多くの異なるプロモーターが組換えベクター中で用いられ得る。使用可能なプロモーターの例は、以下を含む：マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３，１９８２）；ヘルペスウイルスの最初期プロモーターおよびＴＫプロモーター（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６２４９−６２５８，１９９５）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０，１９８１）；およびヒトＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０，１９８５）；ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：５１１，１９８４；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０，１９８５）；Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ（ＦＭＶ）からの全長転写物プロモーター（Ｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３Ｄ：３０１，１９８９）およびＴＭＶからのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７，１９８７）。組換え発現ベクターを構築するために使用できる付加的なプロモーターは以下を含む：リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）からの光誘導性プロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：１６７１，１９８４；およびＢｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：８３８，１９８４）；マンノピンシンターゼプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：２７２３，１９８４）；ノパリンシンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）プロモーター（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：７８３１−４６，１９８４）；オクトピンシンターゼ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＯＣＳ）プロモーター（Ｋｏｎｃｚ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１５９７−６０３，１９８３）；および熱ショックプロモーター（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）、例えば、ダイズｈｓｐｌ７．５−Ｅまたはｈｓｐｌ７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ ｅｌ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：５５９，１９８６；Ｓｅｖｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：８２７，１９９０）。]
[0066] プロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導可能な天然プロモーターの両方、ならびに操作されたプロモーターを含み得る。ＣａＭＶプロモーターは構成的プロモーターの例である。最も有用となるために、誘導可能なプロモーターは１）誘導因子の不在下では低発現を与え；２）誘導因子の存在下では高発現を与え；３）植物の正常な生理機能を妨げない誘導スキームを使用し；かつ４）他の遺伝子の発現に影響しない必要がある。]
[0067] いくつかの実施形態において、組換えベクターは任意に選択可能なマーカーを含有できる。マーカーは典型的に、そのマーカーを含有する宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能にするような形質または表現型をコードする。ある実施形態において、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であることによって、適切な抗生物質を用いて、形質転換されていない細胞の中から形質転換された植物細胞を選択できる。好適な選択可能なマーカーの例は、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）を含む。その他の好適なマーカーが当業者に公知である。たとえばＧＵＳレポーター遺伝子（ｕｉｄＡ）、ルシフェラーゼまたはＧＦＰ遺伝子などのスクリーニング可能なマーカーである。]
[0068] ＩＶ．目的のポリペプチドの生成促進のための宿主細胞
翻訳エンハンサーポリヌクレオチドおよび関連のベクターは、さまざまな産業的および治療的適用において有用である。いくつかの実施形態においては、増加したレベルの治療タンパク質または産業的有用性を有するタンパク質を発現するためにこうした発現ベクター／宿主細胞系を用いる方法が提供される。たとえば、ベクターによって発現され得る治療タンパク質は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）などの治療抗体、疾患をもたらすバクテリアまたはウイルス（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、マラリア、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、ＨＢＶ、およびサイトメガロウイルス）などのさまざまな病原体からのポリペプチド抗原、ならびにその他のタンパク質、たとえばラクトフェリン、チオレドキシンおよびベータカゼインワクチンを含み得る。その他の好適なタンパク質または好適なポリペプチドは、たとえば以下のものを含む：栄養的に重要なタンパク質；成長促進因子；植物における早期開花のためのタンパク質；特定の環境条件下で植物に保護を与えるタンパク質、たとえば、金属またはその他の有毒物質、たとえば除草剤もしくは農薬に対する耐性を与えるタンパク質；極端な温度に対する耐性を与えるストレス関連タンパク質；真菌、バクテリア、ウイルス、昆虫および線虫に対する耐性を与えるタンパク質；特定の商業的価値を有するタンパク質、たとえばＥＰＳＰシンターゼなどの代謝経路に関わる酵素。]
[0069] 目的の遺伝子および本明細書に記載されるｍＲＮＡＴＥＥまたはエンハンサーポリヌクレオチドを有する組換えベクターは、当該技術分野において公知のあらゆる手段によって適切な宿主細胞に導入され得る。たとえばベクターは、リン酸カルシウム共沈によって、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションなどの従来の機械的手順によって、リポソームに入れられたプラスミドの挿入によって、およびウイルスベクターによって、宿主細胞にトランスフェクトされてもよい。これらの技術はすべて当該技術分野において周知であり、ルーチン的に実施されている。例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）；およびＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３，１９８８。トランスフェクトされた組換えベクターを有する宿主細胞は、ベクター上に存在する選択マーカーを用いて識別および単離できる。次いで、ベクター含有細胞を選択する培地中で多数のレシピエント細胞を生育してもよい。これらの細胞を直接使用してもよいし、発現された組換えタンパク質を、たとえば抽出法、沈殿法、クロマトグラフィー法、アフィニティー法、電気泳動などの従来の方法に従って精製してもよい。使用される正確な手順は、生成される特定のタンパク質および使用される特定のベクター／宿主発現系によって決まる。]
[0070] ある実施形態において、組換えベクターを発現するための宿主細胞は真核生物細胞である。真核生物ベクター／宿主系および哺乳動物発現系は、発現された哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後修飾、たとえば一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、および有利には発現した生成物の分泌が起こることを可能にする。したがって、哺乳動物細胞などの真核生物細胞は、目的のポリペプチドのタンパク質に対する宿主細胞とすることができる。こうした宿主細胞系の例は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＮＳ０およびＷ１３８を含む。]
[0071] いくつかの実施形態においては、目的のタンパク質の発現を導くための組換えウイルスまたはウイルスエレメントを使用する、操作された哺乳動物細胞系が用いられる。たとえば、アデノウイルス発現ベクターを用いるときには、目的のタンパク質のコード配列を、ＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドとともに、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、たとえば後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列に結合してもよい。このキメラ遺伝子を、次いでインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入によって、生存可能でありかつ感染した宿主中で目的のポリペプチドを発現できる組換えウイルスがもたらされる（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９，１９８４を参照）。代替的には、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターが用いられてもよい（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４，１９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１，１９８２を参照）。特に興味深いのは、染色体外エレメントとして複製する能力を有する、ウシパピローマウイルスに基づくベクターである（Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６，１９８１）。これらのベクターは、ｎｅｏ遺伝子などの選択可能なマーカーをプラスミドに含ませることによって、安定発現のために用いることができる。代替的には、宿主細胞に目的の遺伝子を導入して発現を導くことができるベクターとして用いるために、レトロウイルスゲノムを改変できる（Ｃｏｎｅ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９−６３５３，１９８４）。メタロチオニンＩＩＡプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むがこれに限定されない誘導可能なプロモーターを用いても、高レベル発現が達成され得る。]
[0072] 組換えベクターの発現のための宿主細胞は、酵母であってもよい。酵母において、構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターを含有するいくつかのベクターが用いられてもよい。たとえば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）；およびＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｔｒａｔｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）を参照されたい。ＡＤＨもしくはＬＥＵ２などの構成的酵母プロモーター、またはＧＡＬなどの誘導可能なプロモーターが用いられてもよい。代替的には、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組込みを促進するベクターが用いられてもよい。]
[0073] 植物の発現ベクターが用いられる場合、目的の遺伝子の発現は、いくつかのプロモーターのいずれによって駆動されてもよい。たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０〜５１１−５１４，１９８４）またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，６：３０７−３１１，１９８７）のウイルスプロモーターが用いられてもよい。代替的には、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：１６７１ １６８０，１９８４；およびＢｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：８３８−８４３，１９８４）または熱ショックプロモーター（Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：５５９−５６５，１９８６）などの植物プロモーターが用いられてもよい。]
[0074] 組換えベクターによって目的のタンパク質を発現するために用いられ得る代替的な発現系は、昆虫系である。こうした系の１つにおいては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で生育する。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列がウイルスの非必須領域にクローニングされて、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化して、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク性のコートを欠いたウイルス）の生成がもたらされる。次いでこれらの組換えウイルスを用いて、挿入された遺伝子を発現する細胞に感染させる。たとえば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．４６：５８４，１９８３；およびＳｍｉｔｈ，米国特許第４，２１５，０５１号）を参照されたい。]
[0075] 組換えベクターが適切な宿主細胞に導入された後、発現された組換えタンパク質を、たとえば抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの従来の方法に従って精製してもよい。使用される正確な手順は、生成される特定のタンパク質および使用される特定の発現系の両方によって決まる。組換えタンパク質の長期にわたる高収量の生産に対しては、安定発現が好ましい。複製開始点を含有する発現ベクターを用いる代わりに、宿主染色体へのベクターの安定な組込みを可能にするベクターによって宿主細胞を形質転換することもできる。目的のタンパク質をコードする安定に組込まれたポリヌクレオチドを有する宿主細胞は、生育して増殖巣を形成でき、次にこの増殖巣をクローニングして細胞系に拡張できる。たとえば、外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間生育させ、次いで選択培地に切換えてもよい。]
[0076] Ｖ．治療的適用
さまざまな治療的適用に用いられ得るベクター系がさらに提供される。たとえば、上述のｍＲＮＡＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドと、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドとによって、タンパク質の治療的発現のためのベクターを構築できる。その他の例は、抗原生成の増加を達成できるような、ワクチンにおいて使用されるベクターを含む。]
[0077] いくつかの実施形態において、本明細書に開示される翻訳エンハンサーエレメントおよびポリヌクレオチドは、ＤＮＡワクチンの調製に用いられる。増加したレベルの抗原を生成するために、一般的にＤＮＡワクチンは発現ベクターを含むことができ、その発現ベクターでは１つまたはそれを超える翻訳エンハンサーエレメント（例えば、配列番号１〜３５）の存在によって、ワクチン抗原の発現が促進される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡワクチンは２つ以上の抗原を送達し発現することができる。ＤＮＡワクチンベクターは、ワクチン抗原をコードする配列および翻訳エンハンサーエレメントの他に、典型的には真核生物細胞中で活性である転写開始のためのプロモーターも含む。こうしたＤＮＡワクチンベクターは、当該技術分野において周知の方法に従って生成できる。たとえば、所与の抗原に対するＤＮＡワクチンを作成して使用する方法は、例えば、Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：９２７，２０００；Ｋｒｉｅｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８９：１０７，１９９９；Ｃｉｃｈｕｔｅｋ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，１００：１１９，１９９９；Ｄａｖｉｓ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．，１：７，１９９９；およびＬｅｉｔｎｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：７６５，１９９９に記載されている。]
[0078] ＤＮＡワクチンにおいてワクチン抗原を発現するために、上記のいずれのベクターが用いられてもよい。ＤＮＡワクチンを構築するために使用できる付加的なベクターは、ウイルスベクター、たとえばＡＬＶＡＣ（カナリアポックスウイルス）、ＭＶＡ（牛痘変異体）およびＡＤＶ５（アデノウイルス５）ベクター、ならびにプラスミドベクター、たとえばｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ＃３７２５４）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＮＧＶＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＭＩ）、ｐ４１４ｃｙｃ（ＡＴＣＣ＃８７３８０）、ｐＢＳＬ１３０（ＡＴＣＣ＃８７１４５）、およびｐＥＣＶ２５（ＡＴＣＣ＃７７１８７）を含み得る。ワクチンベクターにおいて使用できるプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサー、および本明細書に記載されるさまざまな真核生物プロモーターを含む。]
[0079] ＤＮＡワクチンによって多様な一連のワクチン抗原が発現され得る。これらのワクチン抗原は、たとえばＨＩＶ−１抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ抗原、セムリキ森林ウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ抗原およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原を含む。ＤＮＡワクチン中で発現され得る抗原の付加的な情報は、ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ．ｃｏｍのウェブサイトから得ることができる。]
[0080] ＤＮＡワクチンは、病原体の感染（例えば、ＨＩＶ感染）に対する予防または保護が必要なあらゆる対象を免疫化するために用いられ得る。こうした対象は、ヒトおよびヒト以外の動物、たとえば齧歯動物（例えば、マウス、ラットおよびモルモット）、ブタ、ニワトリ、フェレット、ヒト以外の霊長類を含む。ＤＮＡワクチンを好適な対象に投与する方法は、当該技術分野において説明されている。たとえば、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃ．，１２：１４９５−１４９８，１９９４；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：１９６４，１９９９；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１，１９９９；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．２５７：３５２，１９９９；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：７４７，１９９６；Ｋｏｄｉｈａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３３９１，１９９７；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：８６５，１９９７；Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９２４，１９９７；Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７５：３８９，１９９７；Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：１８９３，２０００；Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８１：４７６，２０００を参照されたい。]
[0081] 本明細書に記載される特定のＴＥＥまたはｍＲＮＡ翻訳エンハンサーポリヌクレオチドの１つまたは複数を用いることによってワクチン抗原の発現を促進することに加え、ＤＮＡワクチンをアジュバントとともに調合することもできる。使用できる好適なアジュバントは、たとえばリン酸アルミニウムまたはヒドロキシリン酸アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、ＱＳ−２１サポニン、デキサメタゾン、ＣｐＧＤＮＡ配列、コレラ毒素、サイトカインまたはケモカインを含む。こうしたアジュバントは、ＤＮＡワクチンの免疫原性を高める。こうした改変されたＤＮＡワクチンを調製する方法は当該技術分野において公知である。たとえば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１８，２０００；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２１３６−２１４０，１９９１；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：３５２０−３５２８，１９９７；Ｌｏｄｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１０５９−１０６６，２０００；Ｓａｓａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４９３１，１９９８；Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９９０３，１９９４；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：８７０，１９９８；Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９２：９０，１９９９；Ａｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７６：２８０，１９９８；およびＨａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：３０９７−３１０５，２０００を参照されたい。]
[0082] いくつかの実施形態においては、さまざまな疾患の処置における治療タンパク質の発現を促進するための方法が提供される。これらの方法においては、翻訳エンハンサーエレメントまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを有して治療タンパク質を発現する発現ベクターを、ベクターと標的細胞との相互作用によって、エクスビボまたはインビボで標的細胞にトランスフェクトする。対象における治療的応答を誘発するために十分な量の組成物が対象に投与される。こうした遺伝子治療手順は、いくつかの状況において、後天的な遺伝子の欠損および遺伝された遺伝子の欠損、癌およびウイルス感染を直すために用いられてきた。たとえば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３，１９９２；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７，１９９３；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６，１９９３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２６−９３２，１９９３；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５，１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，１９９２；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１４９−１１５４，１９９８；Ｖｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌ．ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：３５−３６，１９９５；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１：３１−４４，１９９５；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ＆ Ｂｏｅｈｍ編，１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６，１９９４を参照されたい。]
[0083] さまざまな疾患および障害が、本明細書に記載される治療法による処置に対して好適である。好適な疾患および障害は、たとえば肺、胸部、リンパ、胃腸、および尿生殖器などのさまざまな器官系の悪性疾患を含む。悪性疾患を含む腺癌、たとえばほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、小腸の癌および食道癌も処置に好適である。本明細書に開示されるｍＲＮＡＴＥＥまたは翻訳エンハンサーポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、非悪性の細胞増殖性疾患、たとえば乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、および脂質組織球症の処置にも有用である。本質的に、治療タンパク質によって処置または改善できるあらゆる障害が、ベクター中の翻訳エンハンサーエレメントの存在によって増加したレベルの治療タンパク質を発現する発現ベクターによる処置に対して感受性があると考えられる。]
[0084] 本明細書に記載される治療法を実施するために、多数の送達法を用いることができる。これらの方法はすべて当業者に周知である。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビークルと複合化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系はＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含み、これらは細胞に送達された後にエピソームゲノムまたは組込まれたゲノムのいずれかを有する。核酸の非ウイルス性送達の方法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で促進されたＤＮＡの取込みを含む。リポフェクションは、たとえば米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに対する好適なカチオン性脂質および中性脂質は、たとえば国際公開第９１／１７４２４号および国際公開第９１／１６０２４号に記載されるものを含む。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対するものであってもよい。]
[0085] 多くの遺伝子治療適用においては、遺伝子治療ベクターが特定の組織型に対する高度の特異性を伴って送達されることが望ましい。ウイルスベクターは典型的に、ウイルス外表面のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変される。リガンドは、目的の細胞型の上に存在することが公知である受容体に対して親和性を有するように選択される。たとえば、Ｈａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：９７４７−９７５１，１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変してｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現させることができ、この組換えウイルスはヒト上皮増殖因子受容体を発現している特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスと受容体を発現する標的細胞との他の対に広げることができる。たとえば、糸状ファージを操作して、実質的にあらゆる選択された細胞受容体に対し特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を表示させることができる。上記の説明は主にウイルスベクターに当てはまるが、非ウイルスベクターに同じ原理が適用されてもよい。こうしたベクターは、特定の標的細胞による取込みに有利であると考えられる特定の取込み配列を含有するように操作され得る。]
[0086] 以下に記載するとおり、発現ベクターは、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用による個体対象への投与によって、インビボで送達できる。代替的に、ベクターはエクスビボで、個体対象から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検物）または一般的なドナーの造血幹細胞などの細胞に送達されてもよく、その後、通常はベクターを取込んだ細胞の選択後に、その細胞を対象に再移植してもよい。診断のため、研究のためまたは遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介したもの）のためのエクスビボの細胞トランスフェクションは当業者に周知である。ある実施形態において、細胞を対象生物から単離し、核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）によってトランスフェクトし、その対象生物（例えば、対象）に再注入してもどしてもよい。エクスビボのトランスフェクションに好適なさまざまな細胞型は当業者に周知である（例えば、対象からの細胞の単離方法および培養方法の考察については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４））およびそこに引用される文献を参照されたい）。]
[0087] 以下の実施例はさらなる例示として提供されるものであって、範囲を制限するためのものではない。他の変更形は当業者に容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲に包含される。]
[0088] （実施例１）
翻訳エンハンサーを同定するためのポジティブフィードバックベクター系
ＴＥＥの同定は、二重モノシストロニックポジティブフィードバックベクターの使用を伴った：一方のシストロンはＧａｌ４ＶＰ１６転写因子をコードし、他方はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする。どちらのシストロンも４コピーの上流活性化配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＵＡＳ）を有するミニマルプロモーターを含有し、この配列はＧａｌ４ＶＰ１６に結合されると転写を促進する。細胞に導入されるとき、ミニマルプロモーターは非常に低レベルのｍＲＮＡおよびコードされるタンパク質の両方を駆動する。Ｇａｌ４ＶＰ１６シストロンの５’リーダーへの翻訳を促進できる配列の導入によって、Ｇａｌ４ＶＰ１６ ｍＲＮＡの翻訳が駆動される。次いでＧａｌ４ＶＰ１６タンパク質が両方のプロモーターに結合でき、２つの遺伝子のプロモーター中の特定の結合部位を介して転写を増加し、自身の転写および他方のシストロンの転写を駆動することによって、ポジティブフィードバックループを開始する。ＴＥＥはランダムヌクレオチド配列のライブラリーから同定された。ある実施形態において、高感度ＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ：ＥＧＦＰ）をコードするシストロンのみが用いられ、信号対ノイズ比を改善して、トランスフェクトされた細胞当りの単一ライブラリープラスミドの単離を可能にした。確認は、ポジティブフィードバック系と非増幅ベクター系との両方におけるテストを伴った。]
[0089] 図１は、ポジティブフィードバックベクターを、さまざまなプロモーター（Ｐ１）配列および転写エンハンサー（Ｐ２）配列、転写因子（ＴＦ）遺伝子、および目的の遺伝子とともに模式的に表わした図である。転写因子遺伝子および目的の遺伝子は、同じプラスミド上にあっても異なるプラスミド上にあってもよい。選択適用のために、転写因子ｍＲＮＡの５’リーダーにｎヌクレオチドの長さのランダムヌクレオチド配列（Ｎ）が存在する。翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）として機能する配列は、このｍＲＮＡの翻訳を促進する。次いで、コードされる転写因子が２つの遺伝子のプロモーター中の部位に結合し、それらの転写を増加させる。実施形態の１つにおいて、このコンストラクトは２つのｍＲＮＡを発現する：一方はレポータータンパク質であってもよい目的のタンパク質をコードし、他方は転写因子をコードする。どちらのｍＲＮＡの転写もミニマルプロモーターによって駆動されるが、両方の遺伝子のプロモーター中に位置する転写因子に対する結合部位を介して、転写因子の発現によって促進され得る。ミニマルプロモーターからは少量の転写因子ｍＲＮＡが発現されるが、このｍＲＮＡの翻訳は、転写因子をコードするｍＲＮＡの５’リーダー中の障害によって遮断される。この障害は安定なステムループ構造および／または上流のＡＵＧ開始コドンであってもよい。この転写因子の合成は、この因子をコードするｍＲＮＡ中の翻訳エンハンサーの存在に依存する。] 図１
[0090] 図２は、翻訳エンハンサーに駆動されるポジティブフィードバックベクターを、宿主タンパク質合成を遮断するための第３のタンパク質とともに示す図である。最初の２つの遺伝子（転写因子遺伝子および目的の遺伝子）は図１と同じであるが、３つのｍＲＮＡすべてがその５’リーダーにＴＥＥを含有する。第３のタンパク質（例えば、ロタウイルスＮＳＰ３タンパク質）は、宿主ｍＲＮＡの翻訳を遮断してそれらからの競合を低減させることによって、最初の２つのコードされるｍＲＮＡの翻訳を増加する。第３の遺伝子はプロモーターＰ３の転写制御下にあり、Ｐ３は構成的プロモーターであるかまたは誘導可能なプロモーターである。Ｐ３はプロモーターエレメントＰ１およびＰ２も含んでいてもよい。選択適用のために、目的の遺伝子および第３のタンパク質に対するｍＲＮＡは公知のＴＥＥを含有し、一方転写因子遺伝子はランダムヌクレオチド配列を含有する。このシナリオにおいて、ＴＥＥは第３のタンパク質の活性に抵抗性である。タンパク質生成適用のために、３つの遺伝子すべてが、第３のタンパク質の活性に抵抗性である公知のＴＥＥを含有してもよい。３つの遺伝子は、１個、２個または３個の異なるプラスミド上にあってもよい。] 図１ 図２
[0091] ＴＥＥを同定するためのポジティブフィードバック系を使用するより詳細な手順は、たとえば国際公開第２００７／０２５００８号において、過去に記載されている。]
[0092] （実施例２）
コンセンサス翻訳エンハンサーモチーフの同定
上記のとおりの二重モノシストロニックポジティブフィードバックベクター系を用いて、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）、およびＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓（Ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ））細胞を含むその他の細胞系において翻訳エンハンサーとして機能する多数の短いヌクレオチド配列を同定した。これらの翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）は７ヌクレオチドから１２ヌクレオチド長の範囲である。図３に示されるとおり、これらのＴＥＥの複数コピーがＣＨＯ細胞においてタンパク質生成を最高２５倍増加した。各実施例において、ホタルルシフェラーゼシストロンの５’リーダー中には同じＴＥＥが少なくとも５コピーつながれている。第１のコンストラクトは、ＴＥＥを含有しないサイズ適合した対照である。コンストラクトをＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトして、２日後にアッセイした。翻訳効率はサイズ適合した対照コンストラクトの活性に対するものである。図３において、対照バーの下にある上から１３本のバーは、それぞれ１３個の異なるＴＥＥの５コピーによって得られた結果に対応する。次の２本のバーは、別のＴＥＥの５コピーまたは１５コピーにおける翻訳促進活性を示す。下部のバーは、さらに別のＴＥＥ配列を５〜２５コピー用いたときの翻訳促進活性を示す。] 図３
[0093] これらのＴＥＥのうちいくつかは配列類似性を示し、これらのＴＥＥからは推定コンセンサスモチーフが同定された（図４を参照）。ＴＥＥモチーフの２つの実施形態の配列は次のとおりである：ＲＮＳＧＡＧＭＧＲＭＲ（配列番号１）、およびＭＳＣＳＧＣＮＧＭＷＡ（配列番号２）。なおこれらの配列において、ＲはＡまたはＧを示し、ＭはＡまたはＣを示し、ＳはＧまたはＣを示し、ＷはＡまたはＵを示し、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵを示す。] 図４
[0094] 別の実施形態において、モチーフ１ａ配列はＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）である。この配列において、Ｒ１は無いか、有るときにはＡまたはＧであり；Ｎ１は無いか、有るときにはＡ、ＣまたはＧであり、好ましくはＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくはＡまたはＧであり、Ｒ１およびＲ２は同じでも異なっていてもよく；Ｍ２は無いか、有るときにはＡまたはＣであり、好ましくはＡまたはＣであり；Ｒ３は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくは無く；Ｒ４は無いか、有るときにはＣであり、好ましくは無い。別の実施形態において、モチーフ１ａ配列はＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）であり、ここでＲ１、Ｒ３およびＲ４は無く；Ｎ１はＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１はＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２はＡまたはＧであり、Ｍ２はＡまたはＣである。]
[0095] 別の実施形態において、モチーフ２ａ配列はＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）である。この配列において、Ｒ５は無いか、有るときにはＡであり、好ましくは無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＣまたはＡであり、好ましくはＣまたはＡであり；Ｓ２は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｓ３はＧまたはＣであり；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ４はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡまたはＴであり、Ｒ６は無いか、有るときにはＡである。別の実施形態において、モチーフ２ａ配列はＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）であり、ここでＲ５およびＲ６は無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＡまたはＣであり；Ｓ２はＣまたはＧであり；Ｓ３はＣまたはＧであり、Ｓ２およびＳ３は同じでも異なっていてもよく；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ２はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡである。]
[0096] （実施例３）
合成ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントの活性
上記のコンセンサスモチーフに基づいて、全体的にモチーフ１およびモチーフ２に対応するさまざまな特定のＴＥＥ配列を合成して、翻訳促進活性をテストした（表１の配列番号５〜３５を参照）。合成されて互いにアニーリングされた２本の重複する相補オリゴヌクレオチドから、テスト配列を含有するＤＮＡ断片を生成した。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは各端部に塩基対非形成のヌクレオチドを有し、ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１を用いてベクターにクローニングするための粘着末端を与えた。この断片を、実施例１に記載されるとおりのポジティブフィードバック発現ベクター中のルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡの５’リーダーにクローニングした。次いで、モチーフ配列を含有するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコンストラクトをＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトした。３日後に、テスト配列が翻訳を促進する能力について細胞をアッセイした。サイズ適合対照（参照）プラスミドは、クローニング領域にポリＡを含有した。レポーターポリペプチドの翻訳効率に対するＴＥＥの影響を図５に示す。] 図５
[0097] その結果、コンセンサスモチーフは、これらのモチーフの１つに対応するＴＥＥの翻訳促進活性を予測することが示される。図面に示されるとおり、モチーフ１に基づくＴＥＥ配列は、モチーフ２に基づく配列よりも高レベルまで翻訳を促進する傾向がある。]
[0098] 本明細書に記載される新規の翻訳エンハンサーは、さまざまな実用的および産業的適用を有し得る。たとえば、これらの翻訳エンハンサーは産業規模の培養に関連するコストを最小化して薬物コストを低減できる。タンパク質濃度が高くなることでタンパク質精製も容易にできる。加えて、これらのエンハンサーは、たとえば免疫応答を生じさせるための十分な抗原をＤＮＡワクチンから発現することなど、別様ではタンパク質発現が少ないために不可能であり得るようなプロセスを可能にし得る。これらの翻訳エンハンサーは、哺乳動物細胞における特定のタンパク質の収量を劇的に増加させるために用いることができる。たとえば、多くの治療タンパク質は、適切な転写後プロセシングを確実にするために、治療タンパク質の大規模生産のために最も一般的に使用される細胞であるＣＨＯ細胞中で発現される。翻訳エンハンサーは、産業的タンパク質生産に加えて、さまざまなベクター系にも使用できる可能性がある。たとえば、研究の目的のため、タンパク質の治療的発現のため、およびＤＮＡワクチンのため、抗原生成を増加させるためである。]
[0099] この明細書は多くの詳細を含み、その好ましい実施形態を参照して記載されているが、これらは請求されるかまたは請求され得る発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではなく、特定の実施形態に対する特定的な特徴の説明と解釈されるべきである。記載される本発明の意味から逸脱することなく形状および詳細にさまざまな変更が行なわれ得ることが当業者に理解されるであろう。本明細書において別個の実施形態の状況において記載される特定の特徴が、単一の実施形態において組合せて実現されることもできる。反対に、単一の実施形態の状況において記載されるさまざまな特徴が、単独またはあらゆる好適な部分的組合せで複数の実施形態において実現されることもできる。さらに、上記においては特徴が特定の組合せで作用するものとして記載され、最初にそのように請求されているかもしれないが、場合によっては請求される組合せからの１つまたはそれを超える特徴が組合せから削除されてもよく、請求される組合せは部分的組合せまたは部分的組合せの変形に向けられてもよい。本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定められる。]
実施例

[0100] 本明細書において引用されるすべての出版物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、および特許出願は、その各々が特定的かつ個別に引用により援用されることが示されるのと同様に本明細書において引用により援用される。]

权利要求:

請求項1
少なくとも１つのｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含む単離ポリヌクレオチド配列であって、前記ＴＥＥはＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４（配列番号３）もしくはＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６（配列番号４）、またはそれと実質的に同一の配列からなり、ここで：Ｒ１は無いか、有るときにはＡまたはＧであり；Ｎ１は無いか、有るときにはＡ、ＣまたはＧであり、好ましくはＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくはＡまたはＧであり、Ｒ１およびＲ２は同じでも異なっていてもよく；Ｍ２は無いか、有るときにはＡまたはＣであり、好ましくはＡまたはＣであり；Ｒ３は無いか、有るときにはＡまたはＧであり、好ましくは無く；Ｒ４は無いか、有るときにはＣであり、好ましくは無く；さらに、Ｒ５は無いか、有るときにはＡであり、好ましくは無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＣまたはＡであり、好ましくはＣまたはＡであり；Ｓ２は無いか、有るときにはＣまたはＧであり、好ましくはＣまたはＧであり；Ｓ３はＧまたはＣであり；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ４はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡまたはＴであり、Ｒ６は無いか、有るときにはＡである、単離ポリヌクレオチド配列。
請求項2
前記ＴＥＥはＲ１Ｎ１Ｓ１ＧＡＧＭ１ＧＲ２Ｍ２Ｒ２Ｒ３Ｒ４からなり、ここでＲ１、Ｒ３およびＲ４は無く；Ｎ１はＡ、ＣまたはＧであり；Ｓ１はＣまたはＧであり；Ｍ１はＡまたはＣであり；Ｒ２はＡまたはＧであり、Ｍ２はＡまたはＣである、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
請求項3
前記ＴＥＥはＲ５Ｍ３Ｓ２ＣＳ３ＧＣＮ２ＧＭ４ＷＲ６からなり、ここでＲ５およびＲ６は無く；Ｍ３は無いか、有るときにはＡまたはＣであり；Ｓ２はＣまたはＧであり；Ｓ３はＣまたはＧであり、Ｓ２およびＳ３は同じでも異なっていてもよく；Ｎ２はＧ、ＣまたはＴであり；Ｍ２はＡまたはＣであり；Ｗは無いか、有るときにはＡである、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
請求項4
前記ＴＥＥは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一の配列からなる、請求項１、２または３に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
請求項5
前記ＴＥＥは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と同一の配列からなる、請求項１、２または３に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
請求項6
少なくとも２コピーの前記ＴＥＥを含む、請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチド配列。
請求項7
少なくとも５コピーの前記ＴＥＥを含む、請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチド配列。
請求項8
少なくとも１０コピーの前記ＴＥＥを含む、請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチド配列。
請求項9
真核生物細胞においてポリペプチドを組換えによって発現するためのベクターであって、少なくとも１つのｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含むポリヌクレオチド配列に動作可能に連結した真核生物プロモーターを含み、前記ＴＥＥは請求項１、２または３に記載の前記ＴＥＥから選択される、ベクター。
請求項10
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と実質的に同一の配列からなる、請求項９に記載のベクター。
請求項11
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と同一の配列からなる、請求項９に記載のベクター。
請求項12
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、前記プロモーターに対して３’に位置し、目的のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の方向性ライゲーションに対して適合される、請求項９に記載のベクター。
請求項13
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントに動作可能に連結した目的のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９に記載のベクター。
請求項14
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、前記第２のポリヌクレオチド配列の５’リーダー配列中に位置する、請求項１３に記載のベクター。
請求項15
請求項９に記載のベクターを含む、ＤＮＡワクチン。
請求項16
請求項９に記載のベクターによってトランスフェクトされる、真核生物宿主細胞。
請求項17
前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
請求項18
ポリペプチドを組換えによって生成するための方法であって、前記方法が、（ｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに各々動作可能に連結した真核生物プロモーターとｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントとを含む発現ベクターを構築する工程であって、前記ＴＥＥは請求項１、２または３のいずれか１項に記載の前記ＴＥＥから選択される、構築する工程と（ｉｉ）前記発現ベクターを真核生物宿主細胞にトランスフェクトする工程と；（ｉｉｉ）前記発現ベクターによってトランスフェクトされた前記宿主細胞を培養する工程とを含み、これにより前記ポリペプチドを生成する、方法。
請求項19
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と実質的に同一の配列からなる、請求項１８に記載の方法。
請求項20
前記ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントは、配列番号５〜３５からなる群より選択される配列と同一の配列からなる、請求項１８に記載の方法。
請求項21
前記組換えポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
請求項22
前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１８に記載の方法。
請求項23
前記ポリペプチドは治療タンパク質である、請求項１８に記載の方法。